聲光可調諧濾波器如何增強共聚焦顯微鏡的多功能性

共聚焦顯微鏡，又稱共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），已在生命科學領域應用數十年。從眼科到神經科學，共聚焦顯微鏡為拯救生命的診斷、治療和研究提供了支持。聲光可調諧濾波器（AOTF）可為共聚焦顯微鏡提供更清晰的圖像、逐像素的波長靈活性和精確控制。G &H 生命科學副總裁Lars Sandstr?m探討了這項技術如何發展以進一步增強共聚焦顯微鏡在生命科學領域的通用性。

從濾光片轉輪到聲光可調濾光器（AOTF）

共聚焦顯微鏡中熒光的激發光源是激光或不同顏色的激光組合。出于技術原因共聚焦選擇激光作為光源。但是傳統激光器通常只發射一條或幾條單一波長的激光譜線（現代化解決方案是白光激光器）。然而，生物醫學成像所使用的熒光染料的激發光譜從近紫外到近紅外的都有。大多數情況下，為了同時檢測幾種不同熒光染料的發射情況，需要通過二向色鏡結合一系列激光譜線來實現。在這種情況下，與在熒光照明中分離激發和發射光的“分光鏡”相比，反射鏡以反向模式使用。由于通常激光器的低頻噪聲頻帶相對較窄，因此不建議直接通過激光功率控制強度。因此，需要一種設備來單獨減弱激光強度。同樣，如果關閉和打開光源次數過多，激光器壽命也會縮短。特別是氣體激光器，在關閉后仍處于高溫狀態而未冷卻時，不適合馬上再次開啟。

“激光電池”滿足以上所有要求，它由一系列激光器（通常為3-5個）組成。所有激光器均配有光閘，光閘由機電驅動并由軟件控制。所有激光器都需要一個用于減弱強度的伺服控制設備（一個帶有一系列灰度濾片濾光片轉輪或滑塊）多譜線激光器還需要另一個濾光片轉輪或滑塊，它包含一系列邊緣濾片和帶通濾片，以便選擇單譜線或組合譜線。顯然，整個設置可能會變得略微復雜低效，容易出現錯位和漂移問題，可能在濾片選擇切換過程中引發機械振動。若改變激發方案，成像的效率將非常低下，由于安裝在濾光輪或滑塊上的濾光片數量有限，該設備靈活度不高。

熒光的激發需要特定顏色的光：既要有效地激發探針（波長接近探針激發光譜的最大值），又要留下足夠的空間收集發射光而不會進入檢測器的光路中。在共聚焦顯微鏡中，通常使用多譜線激光器或激光電池作為激發光源，這需要設備既能夠自由選擇適合當前實驗所用熒光團的激發譜線又能夠控制該激發譜線的強度因為直接在光源處控制強度時，大多數激光器會出現噪音增強的現象。聲光可調諧濾波器（AOTF）的引入簡化了濾光過程，同時顯著提高了實驗的靈活性。聲光可調諧濾波器（AOTF）對于耦合白激光源是唯一的明智選擇。

傳統的“激光電池”帶有5個激光管、5個機械光閘、8個光束組合鏡、5個衰減濾光片轉輪和1個用于多參數共聚焦顯微鏡的選擇激發譜線濾光片轉輪。

如今，共聚焦顯微鏡的生物醫學應用越來越依賴于聲光可調諧濾波器（AOTF）。AOTF技術帶來的精確控制、靈活性和速度提升了共聚焦顯微鏡的多功能性，進而推動了科學創新。隨著對更高圖像清晰度和靈活性的需求不斷增長，AOTF解決方案也可能變得更加復雜，需要特定的綜合專業知識和能力。

聲光可調諧濾波器（AOTF）運行方式

簡化機械設置并將靈活性提高幾個數量級的一個重要步驟是采用聲光可調濾光器（AOTF）。AOTF是一種可以控制所需顏色的光指向一個不同的方向的設備，而其余顏色的光直接通過 AOTF。AOTF由晶體制成，通常是TeO2或SiO2或其他具有類似特性的化合物。晶體由機械轉換器在幾百兆赫范圍內的機械波激發（聲光可調濾光器的“聲”是指機械波，盡管頻率不符合人耳可聽見聲音的頻率）。最重要的是所需光束偏轉的方向是固定的，不會隨光的顏色而改變。此外，指定方向的進光量也可以通過機械波的振幅進行控制。

激光電池發射出不同波長的激光譜線（準直）后，AOTF可以選擇任意波長的譜線使之偏轉至所需方向，并可控制該譜線的能量。AOTF可以真正同時選擇多條譜線，譜線數量主要取決于采購設備具體情況。一個好的系統可同時提供8條譜線。AOTF用機械固定的單晶完全取代了上述所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片，可以輕松實現任意譜線的組合；當激光電池同時提供8條譜線時，組合方式達到256種——這對于AOTF來說不是問題。另外：每條選定的譜線在強度上都是無級可控的。本質上，AOTF是一個“8通道激光調光器”。工程師可能會認為，AOTF將兩種偏振模式導向不同的方向。這是完全正確的，并不損害概念。無論如何，激光都是偏振光，因此光將始終指向既定方向。垂直方向無激光，沒有任何指向。

在以傳統激光電池為光源的共聚焦照明中，AOTF（右邊的方框）替換了所有快門、衰減濾片和譜線選擇濾片，任何進入AOTF的譜線都可以得到抑制、衰減或完全用于共聚焦顯微鏡。由激光器發射的任意譜線都可進行組合（組合數量大但有限）。

AOTF在共聚焦顯微鏡中的應用和優勢

聲光分束器可在特定樣本中進行任一符合熒光染料組成的激光組合。除此以外，假設用兩種不同的熒光染料對標本進行染色，一種非常強，另一種非常弱，而無級調諧通過調暗明亮染料的激發來檢測強度相似的兩種熒光，可以平衡熒光發射強度。因為AOTF的控制速度很快，不需要停止掃描過程，所以很容易在成像過程中即時實現，通過無級控制來平衡激發光強度，不僅有利于對比熒光通道，而且還是改善熒光染料光譜拆分的利器。許多染料的發射光譜出現“拖尾”現象，導致在成像的通道收集了錯誤的信號。通過將激發降至最低，可以改善發射光譜的拆分（抑制串色）。

用不同激光譜線或不同強度的同一條激光譜線掃描感興趣的區域。在激光譜線掃描期間，照明方式會根據預定義的模式在預設點發生變化。任何組合都是可能的，幾乎所有圖形都可以使用鼠標在預掃描的圖像上繪制。當然，也可應用幾何圖案（矩形、圓形、橢圓形……）?！傲憔€”也是一種模式，常用于保護細胞培養物中的背景細胞。

最后，選定譜線的波長（和強度）之間的切換在幾微秒內完成，速度非?？欤幌啾戎?，機械標準濾光片轉輪大約需要一秒鐘。這種快速切換使得在單條譜線的掃描期間可以改變激發方式（采用何種波長的譜線，這些譜線分別對應多大強度）。此功能可在樣本上繪制用不同激發光激發的區域，即所謂的“感興趣區域”，在這些區域中，不同的激光被激活用于成像。此外，無需采集信號的區域不會被照射，非常好地保護了樣本以供日后研究。下圖展示了這類感興趣區域，在單次掃描中應用了5種不同的參數設置。如果選擇白光激光器作為光源，AOTF可以選擇白激光中任何可用的顏色。在此情況下，聲光可調諧濾波器（AOTF）將白激光光源變成可調光源。

聲光 (AO) 元件在共聚焦顯微鏡中有著廣泛的應用，例如調制、功率控制、激光開關、激光耦合和分束。在單個掃描頭中，例如徠卡顯微系統的STELLARIS 8，如下圖。

STELLARIS 8 掃描頭（圖片由徠卡顯微系統公司提供）

聲光元件得到了廣泛應用。特別是聲光可調諧濾波器 (AOTF)，它表現出色，具有諸多優勢，包括：

更清晰的圖像

活體組織檢測的一大挑戰在于如何在不造成樣本移動、分子變化或損傷的情況下快速獲取多光譜數據。聲光可調諧濾波器（AOTF）的多功能性使其能夠分析活細胞。這意味著，借助基于聲光可調諧濾波器（AOTF）的系統所具備的快速強度和波長切換能力，科學家可以監測動態細胞過程。由于這種快速強度和波長切換能力，研究人員現在可以精確地監測完整的動態細胞過程。熒光漂白后恢復（FRAP）、熒光漂白損失（FLIP）以及用戶自定義的小樣本區域（感興趣區域，ROI）等技術已取得了顯著進展。

逐像素波長和功率控制

顯微鏡操作員可以保持高掃描速率，同時逐像素地調整圖像。通過為每個波長和激光器分配不同的強度，可以實現不同信號強度的平衡。聲光可調諧濾波器 (AOTF) 的一個用途是選擇激發波長并設置白光激光器的功率。高級激光復用方案是聲光可調諧濾波器（AOTF）通過選擇系統中的激光源并控制其強度來控制波長和強度。聲光技術可以快速、精確地控制透射率和波長選擇。然后，聲光可調諧濾波器（AOTF）可用作激發濾波器，并且可以“實時”調整。這與傳統的介質帶通濾波器形成鮮明對比，后者任何調整都意味著需要購買新的濾波器。此外，顯微鏡中可安裝的濾波器數量始終存在限制。

環境穩定性

共焦系統中的聲光可調諧濾波器（AOTF）能夠實現對多條激光線的靈活、快速的電子調諧和強度控制，從而消除溫度或濕度變化引起的任何潛在頻率漂移。而使用濾光片轉盤/轉輪的機械調諧方案則很難實現這一點。

技術規格

聲光可調濾波器(AOTF)用于快速和動態地從寬帶或多線激光源中選擇特定波長。當施加射頻頻率變化時，傳輸的波長就會改變，在數十微秒或更短的情況下調整光束或圖像的波長。典型應用領域包括共聚焦顯微鏡、熒光成像、高光譜成像、成像光譜、激光波長調諧、在線過程控制、光譜、波長選擇等。在聲光可調諧濾波器（AOTF）中，射頻驅動頻率施加到壓電換能器（通常為鈮酸鋰）上，產生聲波。該聲波耦合到聲光材料（例如二氧化碲（TeO2））中。由此形成衍射光柵，晶體的折射率隨驅動頻率變化。當相干光束穿過晶體時，只有窄帶頻率的光才能滿足相位匹配條件，并以與未衍射光束不同的角度射出晶體。晶體幾何形狀對于獲得所需的性能至關重要。

大多數高端聲光器件都是按規格定制的，G&H 是領先的專業制造商，提供覆蓋紫外到中紅外波段、帶寬小于 1 nm 的各種聲光可調諧濾波器，具有通光孔徑大、頻率范圍寬、射頻驅動功率低和衍射效率高等優點。G&H 的聲光可調諧系統包括電子控制裝置、可配置驅動器（以提高操作靈活性）和反饋穩定系統（以在任何環境條件下保持波長穩定性）。 G&H 還采用了專利旁瓣抑制技術來提高光譜純度，可按要求提供光纖耦合的AOTF器件。

至關重要的是，G&H是唯一一家能夠自主生長高品質二氧化碲（TeO2）晶體的光學系統開發商。這有助于保持產品的一致性和可靠性，從而生產出更穩定、更可重復的聲光可調諧濾波器（AOTF）產品。我們位于美國的工廠（符合ITAR規定）具備晶體生長、拋光和制造能力，確保了我們始終保持行業領先的標準。新特光電是英國G&H在中國的授權官方合作伙伴，負責G&H所有的聲光器件和電光器件在中國的技術選型、項目實施與全生命周期服務，并提供整套器件集成解決方案，為您提供一站式的產品應用與技術服務！

注：如需詳細規格參數資料，或有其他要求，請聯系武漢新特光電。

下一代共聚焦顯微鏡的驅動力

對于OEM客戶和終端用戶而言，共聚焦顯微鏡的發展方向反饋表明，多功能性是一項關鍵需求。市場對單個系統內可調諧波長范圍更廣的需求日益增長，這不僅能提供更大的靈活性，還能帶來更高的性價比。G&H已提供可覆蓋400-2400 nm波長范圍的單一光源（而非通常所需的三個濾光片），并且正在進一步提升驅動器的靈活性。

溫度效應的管理是另一個需要進一步創新的領域。聲光可調諧濾波器（AOTF）對溫度變化非常敏感。為了克服這一問題，G&H驅動器設計采用了一種芯片，該芯片能夠維持溫度，然后通過反饋系統調節輸出以保持其恒定，這一過程稱為波長鎖定。該集成系統還包含有關晶體結構、序列號等信息的可訪問信息。

為了最大限度地發揮聲光可調諧濾波器（AOTF）系統的潛力及其對用戶的益處，G&H 在顯微鏡系統制造商設計下一代顯微鏡的初期階段就與其展開合作。這種合作方式使制造商能夠提升其顯微鏡和超連續譜光源的性能。

總而言之，經驗表明，采用漸進式而非革命性的方法來制造和集成更有利于卓越的聲光可調諧濾波器（AOTF）和驅動系統。G&H 與顯微鏡行業緊密合作，不斷改進 AOTF 技術，以跟上生命科學和生物光子學應用領域快速發展的步伐。